서론
환경오염원인 동시에 돌연변이원인 수은(Hg)은 건전지를 비롯 한 자동차부품 및 온도계제조 등의 산업원료로 널리 사용되고 있어 환경오염은 물론, 개인의 건강을 크게 위협하고 있다(Son et al., 2013). 수은이 인체에 다량 축적될 경우 중독현상은 물론(Greener and Kochen, 1983), 피부를 비롯한 여러 조직과 기관에 손상을 주 어 각종 질환을 유발한다고 알려져 있다(Song et al., 2002). 수은 중독으로는 1953년부터 1960년대에 일본의 Minamata시에서 크 게 문제가 되었으며(Tsubaki and Takahashi, 1986), 우리나라의 경우 1988년에 온도계와 형광등 제조업체에서 중독발생의 보고가 있었는데(Pearce et al., 1989), 그 이후에도 매년 상당수의 중독현 상이 지속적으로 보고됨으로서 이에 대한 예방이나 치료적 관심이 날로 증가하고 있다(Lavid et al., 2001).
최근, 수은독성에 대한 기전 하나로 산화적 손상(oxidative stress)이 관여한다고 제시되고 있다(Jung et al., 2008). 즉, 유기수 은이 무기수은으로 붕괴될 때 자유라디칼을 발생하여 여러 조직이 나 기관에 심각한 영향을 미침으로서, 이에 대한 치료적 접근을 항 산화 측면에서 시도하려는 연구가 이루어지고 있다(Son et al., 2013).
식물을 비롯한 한약재 및 허브와 같은 천연성분 중에는 페놀화 합물(phenolic compound)에 속하는 플라보노이드(flavonoid)나 폴리페놀(polyphenol)을 비롯하여(Kim et al., 2002), 이소프레 노이드(isoprenoid)에 속하는 카로티노이드(carotenoid) 및 배당 체(glycoside)와 같은 다양한 물질들이 함유되어 있어(Kim et al., 2013), 항암을 비롯한 항염, 항균 및 항산화와 같은 여러 생리활성 을 나타낸다고 알려져 있다(Kikuzaki and Nakatani, 1993).
식물 중 꿀풀(Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai)은 꿀풀 과에 속하는 다년초로서 우리나라 전역의 양지바른 풀밭에 서식하 고 있으며, 6-8월경에 보라색꽃이 반쯤 개화했을 때 전초를 채취하 여 볕에 말려 사용한다(Chang, 2003). 꿀풀에는 우로솔산(urosolic acid)을 비롯한 안토시아닌(anthocyanin), 탄닌(tannin), 루틴(rutin) 및 트리터페노이드사포닌(triterpenoid saponin) 등 다양한 성분 이 함유되어 있어 오래전부터 이뇨를 비롯한 고혈압이나 결핵 및 간염 등의 치료에 사용하여 왔다(Kim et al., 1998). 특히, 탄닌이 나 안토시아닌, 루틴, 사포닌과 같은 성분에는 이의 분자구조에 페 놀화합물과 같은 수산기(-OH)를 수개 가지고 있어 항염이나 항산 화와 같은 강력한 생리활성을 나타낸다고 한다(Li et al., 2007).
본 연구는 수은독성을 분석하기 위하여 유기수은의 일종인 메틸 수은(methylmercuric chloride, MMC)의 독성을 산화적 손상 측 면에서 분석하였으며, 동시에 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 추 출물의 항산화 영향을 조사함으로서 산화적 손상과 관련된 중금속 독성의 치료에 유효한 기능물질의 소재를 알아보기 위하여 시행하 였다.
연구방법
2. 실험방법
1) 약제 제조
본 실험에 사용한 시약으로 메틸수은(methylmercuric chloride, MMC)을 비롯한 vitamin E, pyrogallol, ammonium thiocyanate, linoleic acid, butylated hydroxytoluene (BHT), XTT는 Sigma 사(St Luios. MO, USA)에서 각각 구입하였다. 메틸수은의 제조는 혈청이 포함되지 않은 minimum essential medium (MEM, Gibco) 으로 5, 10, 25, 50 및 100uM 저장액을 만들어 보관한 후 본 실험에 사용하였다. XTT(2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]- 2H-tetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt)는 phosphate buffered saline (PBS)을 이용하여 50ug/mL의 저장액을 만들어 냉암소에 보관한 다음 실험 당일 필요한 양을 직접 배양액에 첨가 하여 사용하였다.
2) 꿀풀 추출
꿀풀(Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai)은 전라북도 익 산시 산야에서 8월경에 잎과 줄기를 채집하여 익산시에 위치하고 있는 대학부설 생명자원과학연구소에서 확인 검정 후 사용하였다. 채집한 전초를 잘 씻어 통풍이 잘되고 서늘한 곳에서 말린 다음 일 정 길이로 잘라 냉암소에 보관하여 시료로 사용하였다. 추출을 위 하여 시료 62.9g을 파쇄한 다음 시료의 3배 정도의 증류수와 함께 1,000mL의 환저플라스크에 넣은 후 2시간 동안 가열하였으며 3 회의 반복과정을 통하여 얻은 추출액을 3,000rpm에서 원침시켰 다. 원침 후 상등액을 모아 여과하여 진공농축기로 감압 농축한 다 음, 동결건조기에서 24시간 동안 건조시킨 후 3.7g의 시료를 얻었 다. 이 때 수율은 5.9%로 나타났다.
3) 세포 배양
NIH3T3 섬유모세포의 배양은 Pattison et al. (2001)의 방법에 따라, 배양용기의 세포를 0.025% trypsin (Sigma)으로 분리하였 다. 분리된 세포들은 원침 후 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma)이 함유된 MEM 배양액에 넣고 1 x 105cells/well이 되도 록 밀도를 조절한 후 96-well plate에 배분하였다. 배분된 세포들은 72시간 동안 36°C, 5%CO2로 조절된 정온기 내에서 배양하였다.
4) 메틸수은의 처리
배양중인 NIH3T3 섬유모세포를 메틸수은이 15~35uM 각각 의 농도로 각각 포함된 배양액에서 72시간 동안 배양 후 세포생존 율을 대조군과 비교 조사하였다.
5) Vitamin E 처리
배양세포를 메틸수은(XTT50)으로 처리하기 2시간 전에 vitamin E가 30과 40uM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 다 음 세포생존율을 메틸수은의 처리군과 비교 조사하였다.
6) 꿀풀 추출물 처리
메틸수은에 대한 꿀풀 추출물의 영향을 조사하기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포에 메틸수은을 처리하기 2시간 전에 꿀풀 추 출물이 60과 80ug/mL의 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 배양한 다음 세포생존율에 의하여 메틸수은의 처리군과 비교 조사 하였다.
7) 세포생존율 분석
세포생존율의 분석은 Mosmann (1983)의 방법에 따라 메틸수 은이나 꿀풀 추출물을 배양 세포에 농도별로 처리한 다음 실험 당 일 제조한 XTT 50ug/mL를 well당 100ul씩 넣은 후 36°C로 조절 된 항온기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 추출을 위 하여 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)로 처리한 다음 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
8) SOD-유사 활성(SOD-like activity) 측정
SOD-유사 활성의 측정은 Marklund and Marklund (1974)의 방법에 따랐다. 즉, Tris-HCl buffer와 10mM pyrogallol을 시료 에 넣고 25°C에서 10분간 처리하였다. 처리 완료 후 HCl로 반응시 킨 다음 ELISA reader로 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, BHT를 양성대조군으로 하여 활성을 비교조사 하였으며 활성은 시 료첨가군과 무첨가군의 차이에 의한 백분율로 표시하였다.
9) 지질과산화 측정
지질과산화는 Kikuzaki and Nakatani (1993)의 방법에 따랐 다. 즉, 3.9mL의 시료를 에탄올과 혼합한 액에 에탄올을 녹인 2,52% linoleic acid와 0.05M PBS (pH 7.0)용액 12.1mL를 첨가 하여 40°C에서 24시간 동안 처리하였다. 처리 후 에탄올과 30% ammonium thiocyanate를 처리하고 0.02M ferrous chloride를 0.1mL를 가한 후 실온에서 반응시켰다. 반응 완료 후 ELISA reader로 500nm에서 흡광도를 측정하였으며 저해능은 대조군에 대한 시료첨가군의 차이를 백분율로 표시하였다.
결과 및 고찰
1. 세포생존율 측정
메틸수은이 배양 NIH3T3 섬유모세포에 미치는 세포독성을 조 사하기 위하여 XTT50농도의 세포생존율을 측정하였다. 이를 위해 메틸수은이 15~35uM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 72 시간 동안 처리한 결과, 메틸수은의 처리 농도에 비례하여 세포생 존율이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다. 이 때 XTT50 농도 는 34.2uM의 처리에서 나타났다(Table 1). 본 실험에서 메틸수은 에 의한 세포생존율의 감소는 메틸수은이 배양 NIH3T3 섬유모세 포에 세포독성을 가지고 있음을 말해주고 있으며, 또한 XTT50 농 도가 34.2uM에서 나타남으로서 Borenfreund and Puerner (1984)에 의한 독성판정기준에 의하여 고독성(highly-toxic)인 것 으로 나타났다. 즉, 화학약제의 MTT50이나 XTT50값이 100uM 이 하로 나타난 경우는 고독성으로, 100-1,000uM로 나타난 경우는 중간독성(mid-toxic)으로, 1,000-2,000uM로 나타난 경우는 저독 성(lower-toxic)으로, 2,000uM 이상으로 나타난 경우는 무독성 (non-toxic)으로 각각 판정하였다(Borenfreud and Puerner, 1984). 본 실험결과는 Song et al. (2002)이 배양 심근세포에서 메틸수은 의 세포독성을 보고한 연구 결과나, Son et al. (2013)이 인체피부 흑색종세포에서 메틸수은의 세포독성을 보고한 결과와도 일치하 였다. 본 연구에서 처럼 메틸수은이 세포독성을 보인 것은 메틸수 은이 세포내 DNA의 구조적 손상이나(Pattison et al., 2001), 또는 단백질합성을 저해하였을 가능성을 배제할 수는 없지만(Zhitkovich et al., 1996), 그 보다는 메틸수은이 산화적 손상에 의하여 배양 세 포를 퇴화시킴으로서 생존율의 감소를 초래하였을 가능성이 클 것 으로 생각된다(Park et al., 1996).
Table 1.
The cell viability of methylmercuric chloride on cultured NIH3T3 fibroblasts by XTT assay.
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Incubation |
XTTz assay (450nm) |
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|---|---|---|
| Concentration of MMCy (uM) | Mean±SDzo | (% of control) |
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| Control | 0.259±0.031 | 100 |
| 15 | 0.185±0.012 | 71.4** |
| 25 | 0.163±0.011 | 62.9** |
| 35 | 0.127±0.090 | 49.0*** |
| MMC (XTT50) | 0.130±0.005 | 50.2*** |
2. 메틸수은에 대한 vitamin E의 영향
메틸수은과 산화적 손상간의 상호관련성을 알아보기 위하여 항 산화제인 vitamin E를 30과 40uM의 농도에서 배양 세포에 전처 리 하였다. 그 결과, XTT50농도의 메틸수은만을 처리한 경우 대조 군에 비하여 세포생존율이 46.8%(0.095±0.007)로 나타난 것에 비하여 30uM vitamin E 처리에서는 65.0%(0.132±0.009)로 나 타났으며, 또한 40uM 농도의 vitamin E 처리에서는 95.6% (0.194±0.013)로 나타났다. 특히, 40uM 농도처리에서는 메틸수 은만의 처리에 비하여 유의한 세포생존율의 증가를 나타냈다 (p<0.001)(Table 2). 본 실험 결과에서 vitamin E는 메틸수은에 의하여 감소된 세포 생존율을 유의하게 증가시켰는데, 이는 Oh et al. (2012)이나 Son et al.(2013)의 연구에서 vitamin E가 메틸수 은의 독성을 감소시켰다는 연구 보고와도 일치하였다. 본 실험 결 과나 타 연구들은 메틸수은의 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있음을 제시하고 있다.
Table 2.
The effect of vitamin E on the cytotoxicity induced by methylmercuric chloride in cultured NIH3T3 fibroblasts.
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Incubation |
XTTz assay (450nm) |
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|---|---|---|
| Concentration of Vit. Ex (uM) | Mean±SDzo | (% of control) |
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| Control | 0.203±0.029 | 100 |
| 34.2uM MMCy | 0.095±0.007 | 46.8 |
| 30 | 0.132±0.009 | 65.0 |
| 40 | 0.194±0.013 | 95.6*** |
3. 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 추출물의 영향
메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 추출물의 영향을 조사하기 위 하여 XTT50값의 메틸수은을 배양 세포에 처리하기 전에 60과 80ug/mL의 꿀풀 추출물을 전처리한 결과, 메틸수은만의 처리에 서는 세포생존율이 대조군에 비하여 41.4%(0.097±0.075)로 나타 난데 비하여 60ug/mL 꿀풀 추출물의 처리에서는 세포생존율이 58.5%(0.138±0.012)로 나타났다. 또한, 80ug/mL 처리에서는 75.8%(0.179±0.018)로 나타나 이는 메틸수은만의 처리에 비하여 유의한 증가를 보였다(p<0.01)(Table 3). 본 연구 결과는 꿀풀 추 출물이 메틸수은의 세포독성을 방어한 것으로서, 이에 대한 원인으 로는 메틸수은이 크롬처럼 DNA와 같은 핵산물질의 합성저해나 (Tsou et al., 1999), 또는 이차전달자의 과발현에 의한 신호전달체 계의 방해와(Gao et al., 2002) 같은 퇴행성 변화의 유도를 꿀풀 추 출물이 억제하였을 가능성도 있겠지만, 이 보다는 메틸수은에 의한 산화적 손상이 꿀풀 추출물의 항산화능에 의하여 방어된 것으로 생 각된다. 따라서 본 연구에서는 꿀풀 추출물의 항산화능을 알아보기 위하여 꿀풀 추출물에 대한 SOD-유사 활성과 지질과산화 저해능 을 조사하였다.
Table 3.
The protective effect of Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai extract on methylmercuric chloride-induced cytotoxicity in cultured NIH3T3 fibroblasts.
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Incubation |
XTTz assay (450nm) |
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|---|---|---|
| Concentration of PVEx(µg/mL) | Mean±SDzo | (% of control) |
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| Control | 0.236±0.031 | 100 |
| MMCy (XTT50) | 0.097±0.075 | 41.4 |
| 60 | 0.138±0.012 | 58.5 |
| 80 | 0.179±0.018 | 75.8** |
4. SOD-유사 활성 측정
SOD-유사 활성을 측정하기 위하여 60과 80ug/mL 농도의 꿀풀 추출물이 각각 포함된 시료를 분석한 결과 60ug/mL 꿀풀 추출물 의 처리에서는 활성이 22.9%(p< 0.05 ) 나타났으며, 80ug/mL의 처리에서는 31.4% (p<0.01)로 각각 나타났다. 특히, 80ug/mL의 꿀풀 추출물의 처리에 있어서 SOD-유사 활성은 비교군으로 사용 한 30uM BHT 활성인 63.8%값의 50%인 것으로 나타났다(Table 4). 본 실험 결과는 꿀풀 추출물이 항산화 효소인 SOD와 같은 자유 라디칼제거능을 가지고 있다는 것을 증명하고 있다. 이같은 꿀풀 추출물의 항산화능은 꿀풀 추출물의 성분 중 탄닌을 비롯한 루틴, 안토시안 및 트리터페노이드사포닌과 같은 항산화 물질에 의한 것 으로 생각된다(Kim et al., 1995). 사포닌은 인삼의 주성분으로서 항산화능을 비롯한, 항염, 항균에 탁월한 약리활성을 나타낸다고 알려져 있으며(Wang et al., 2006), 폴리페놀류인 탄닌이나 안토 시아닌, 이소트레노이드류인 루틴 역시 뛰어난 항산화능과 항독효 과가 있다고 밝혀져 있다(Lavid et al., 2001).
5. 지질과산화 측정
꿀풀 추출물이 지질과산화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 60 과 80ug/mL의 꿀풀 추출물을 분석한 결과 메틸수은만의 처리에서 는 지질과산화가 126.7%로 대조군에 비하여 높게 나타난데 비하 여, 60ug/mL 꿀풀 추출물 처리에서는 112.3%로, 80ug/mL 꿀풀 추출물 처리에서는 91.4%로 각각 나타났다(Table 5). 따라서 지질 과산화 저해능은 메틸수은만의 처리에 비하여 60과 80ug/mL 꿀 풀 추출물에서 각각 14.4%와 35.3%로 감소한 것으로 나타났으며, 특히 80ug/mL 처리에서는 메틸수은만의 처리에 비하여 유의한 감 소를 나타냈다(p<0.01). 지질과산화는 주요 세포막성분인 인지질 의 산화적 손상 정도를 측정하는 것으로서 lactate dehydrogenase (LDH) 활성과 같이 막손상을 정량하는 시험관 내 대표적인 분석법 의 하나이다(Halliwell and Gutteridge, 1984). 본 연구의 결과에 서 처럼 꿀풀 추출물이 지질과산화 저해능을 보인 것은 꿀풀 추출 물이 산화적 손상을 방어하는 항산화능을 가지고 있음을 증명하고 있다. 이는 본 실험에서 행한 SOD-유사 활성의 분석과도 일치하고 있으며, 동시에 꿀풀을 비롯한 대부분 꿀풀과에 속하는 황금 (Scutellaria baicalensis Georg.)이나 익모초(Leonurus sibiricus L.)와 같은 식물들은 플라보노이드계에 속하는 탄닌(tannin)이나 우고닌(woogonin), 바이칼린(baicalin) 및 루틴(rutin)과 같은 유 효한 항산화 성분을 다량 가지고 있기 때문인 것으로 생각된다 (Kim et al., 1998).
Table 5.
The lipid peroxidation of Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai extract measured at a wavelength of 500nm.
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Incubation |
Lipid peroxidation (500nm) |
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|---|---|---|
| Concentration of PVEx(µg/mL) | Mean±SDzo | (% of control) |
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| Control | 0.243±0.018 | 100 |
| MMCy (XTTz 50) | 0.308±0.025 | 126.7 |
| 60 | 0.273±0.036 | 112.3 |
| 80 | 0.222±0.014 | 91.4** |
이상의 연구 결과를 종합하여 볼 때, 수은은 산화적 손상과 관련 하여 배양 NIH3T3 섬유모세포에 강한 세포독성을 나타냈으며, 이 에 대하여 꿀풀 추출물은 SOD-유사 활성을 비롯한 지질과산화 저 해와 같은 항산화능에 의하여 수은의 독성을 유효하게 방어하였음 을 보여 주었다. 그러나 꿀풀 추출물과 같은 천연성분에 대한 생리 활성을 항산화 측면에서 보다 자세히 분석하기 위해서는 세포에 존 재하는 산화적 손상과 관련된 수용체(receptor)를 비롯하여 Bid나 Bad 및 caspase-9와 같은 세포고사(apoptosis) 관련인자간의 상 호작용에 대하여 체계적이고도 지속적인 연구가 필요할 것으로 생 각된다.
적요
본 연구는 돌연변이원(mutagen)의 하나인 메틸수은(methylmercuric chloride, MMC)의 세포독성을 알아보기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포를 재료로 메틸수은의 독성을 산화적 손상측 면에서 조사하였으며, 또한 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 (Prunella vulgaris L. var lilacina Nakai) 추출물의 영향을 세포 생존율을 비롯한 SOD-유사 활성(SOD-like activity) 및 지질과산 화(lipid peroxidation, LP) 저해능과 같은 항산화 측면에서 분석 하였다. 본 실험에서 배양 NIH3T3 섬유모세포에 15~35uM의 메 틸수은을 처리한 결과 처리농도에 비례하여 세포생존율이 대조군 에 비하여 유의하게 감소하였으며, 또한 XTT50값이 34.2uM에서 나타나 고독성(highly-toxic)인 것으로 나타났다. 한편, 항산화제 인 vitamin E는 메틸수은에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시켰다. 메틸수은의 세포독성에 대한 꿀풀 추출물의 영향에 있 어서, 꿀풀 추출물은 메틸수은에 의하여 감소된 세포생존율을 유의 하게 증가시킴으로서 메틸수은의 세포독성을 방어하였으며, 동시 에, SOD-유사 활성 및 지질과산화 저해능을 보임으로서 항산화능 을 나타냈다. 위의 결과로 부터 메틸수은의 세포독성에 산화적 손 상이 관여하고 있으며, 동시에 꿀풀 추출물은 항산화능에 의하여 메틸수은의 산화적 손상을 효과적으로 방어하였다. 따라서, 꿀풀 추출물과 같은 천연물질은 메틸수은과 같이 산화적 손상과 관련된 중금속의 독성을 방어 내지는 치료하는데 있어 항산화 소재로서의 유효한 기능이 있음을 제시하고 있다.
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