서론
환경오염원의 하나인 카드뮴은 수은처럼 독성이 강하기 때문에 이에 의한 중독을 이따이-이따이병(itai-itai disease)이라 부른다 (Jin and Nordberg, 1983). 카드뮴은 내식성이 강하기 때문에 치 과용 아말감을 비롯한 전기도금, 합금, 살충제, 제련 및 안료 등의 여러 산업부문의 공정원료로 사용되고 있다(Nowak and Chmielnicka, 2000). 특히, 카드뮴은 공장의 폐수를 비롯한 연기(fume)나 분진 과 같은 형태로 공기 중에 떠 다니면서 수질과 대기를 오염시킬 뿐 만 아니라 인체의 호흡기계나 소화기계를 통하여 체내로 유입된 후 폐암이나 전립선암과 같은 여러 병변을 유발한다(Coogan et al., 1992). 체내로 들어온 카드뮴은 혈액을 거쳐 간과 신장으로 이동하 며, 간에서는 분해 단백질인 metallothionein을 생성하여 해독작 용을 돕는다. 오염된 음식이나 음료섭취로 인한 고농도의 경구적 흡수는 두통과 구토를 비롯한, 복통, 근육통, 착색뇨 및 체중감소와 같은 임상적 증상을 나타낸다(Lee et al., 2001). 또한 호흡기계를 통한 연기나 분진을 흡입할 경우, 인두부의 통증을 비롯하여 간 및 신장의 부종, 호흡곤란과 같은 증상을 유발한다(Jin and Nordberg, 1983). 그 밖에도 카드뮴의 독성은 자각증상은 물론 폐나 골격계의 장애를 유발한 것으로 알려져 있다(Choi et al., 2012). 만일, 카드 뮴이 피부에 접촉될 경우, 구리나 니켈처럼 알레르기성 접촉피부염 (allergic contact dermatitis)의 요인으로도 작용한다고 한다(Oh et al., 2012).
최근, 수은을 비롯한 크롬, 구리 및 카드뮴과 같은 중금속들은 이 의 붕괴 시 자유라디칼을 생성함으로서 이의 독성이 산화적 손상 (oxidative stress)과 밀접한 관련이 있다는 것이 제시되고 있다 (Leonard et al., 2000). 산화적 손상은 막의 지질을 과산화 시킴으 로서 막손상을 초래할 뿐만 아니라 세포내 칼슘채널과 연관된 N-methyl-D-aspartate(NMDA) 수용체를 과활성시켜 세포내 칼 슘유입을 촉진시킴으로서 그 결과 세포의 퇴화 내지는 사멸을 초래 하게 된다(Park et al., 1996).
최근, 각종 약용식물이나 허브추출물과 같은 천연물질 중에는 항산화를 비롯한 항염, 항균, 항암 등에 매우 효과적인 성분들이 다 량 포함되어 있다고 알려지고 있다(Ma et al., 2003). 예를 들면 페 놀화합물에 속하는 폴리페놀(polyphenol)이나 플라보노이드 (flavonoid)를 비롯하여 카로티노이드(carotenoid) 및 타닌(tannin) 과 같이 인체에 유효한 생리활성을 나타내는 성분들이 밝혀져 있다 (Li et al., 2007). 특히, 페놀류는 이의 분자구조식에 한 개 또는 여 러 개의 수산기(-OH)를 가지고 있어 다른 물질과의 결합력이 뛰어 나기 때문에 항산화 효과를 비롯한 항독효과 및 항염효과와 같은 여러 생리활성 작용에 매우 뛰어난 효능이 있다고 알려져 있다 (Wang et al., 2006).
식물 중 소리쟁이(Rumex crispus L.)는 마디풀과(Polygonaceae) 에 속하는 여러해살이풀로서 우리나라에서는 전국 각지에 분포하 고 있으며 대부분 들판의 약한 습한 땅에 서식하고 있다. 소리쟁이 는 양제라고도 부르며, 꽃은 6-7월경에 초록색으로 피는데, 꽃핀 후 에 4개의 날개가 달린 씨를 맺는다(Park and Choi, 2011). 소리쟁 이는 오래전부터 뿌리나 줄기를 주로 약재로 사용하여 왔는데 초가 을에 채취한 전초를 햇볕에 말려 사용한다. 소리쟁이는 항염작용이 강하여 옴을 비롯한 종기, 류머티스 관절염, 음부습진, 기계충 등의 염증성 질환에 많이 사용되어 왔다. 소리쟁이에는 anthraquinon 유도체인 chrysophanol이나 emodin 및 페놀화합물 성분인 flavonoid와 같은 성분들이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다 (Chang, 2003).
Chrysophanol이나 emodin, flavonoid와 같은 성분은 소리쟁 이와 같은 마디풀과나 꼭두서니과(Rubiaceae), 또는 마편초과 (Verbenaceae) 등에 많이 존재하는 성분으로서 주로 acetatemalonate 경로나 shikimic acid 경로에 의해 생성된다(Lee et al., 1995). Flavonoid는 물론, chrysophanol이나 emodin은 페놀화 합물처럼 이들의 분자구조에 2개 내지는 3개의 수산기를 가지고 있 어 다른 물질과의 화합력이 매우 뛰어나 강력한 항산화나 항염, 항 균작용을 나타낸다고 한다(Krizkova et al., 2000). 그럼에도 불구 하고 소리쟁이의 생리활성에 대한 연구는 많이 되어 있지 않으며 특히 항산화나 멜라닌화에 대한 측면에서의 연구는 더욱 그렇다 (Kim et al., 2004).
최근 배양세포를 이용한 유효물질의 효능검정은 생체에서 행한 것처럼 동일한 효능분석을 할 수 있으며 세포수준에서 질환의 병인 에 대한 기전을 규명할 수 있다. 더욱이, 세포배양은 짧은 시간내에 다수의 동질적인 재료확보와 반복적 실험이 가능하여 재현성이 뛰 어나다는 장점이 있다(Choi et al., 2001).
본 연구는 환경오염원인 염화카드뮴(cadmium chloride, CdCl2) 의 독성을 항산화 측면에서 분석하고 동시에 소리쟁이 추출물이 CdCl2에 의하여 유도된 세포독성과 멜라닌화에 미치는 영향을 조 사하였다.
연구방법
1. 약제 제조
본 실험에 사용한 cadmium chloride(CdCl2)를 비롯한 dimethylsulfoxide(DMSO), vitamin E, phosphate buffered saline(PBS), 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH), ethyl alcohol, sodium hydroxide(NaOH), sodium chloride는 Sigma 사(St Louis. MO, USA)에서 구입하였다. CdCl2의 제조는 working solution을 이용하여 50, 100, 200 및 500uM의 저장액을 만든 후 최종 농도로 희석 사용하였으며, 세포배양은 10%의 fetal bovine serum(FBS, Gibco, USA)이 포함된 minimum essential medium (MEM, Gibco, USA)으로 배양하였다.
2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium -5-caboxanilide, disodium salt(XTT, Sigma, USA)는 실험 전날 50μg/ml로 제조하여 보관한 후 사용하였다.
2. 세포 배양
NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3 fibroblast)는 NIH Swiss mouse 에서 분리계대 배양한 세포주로서, 배양은 Park et al.(1996)의 방 법에 따랐다. 즉, 배양용기에 부착된 세포를 0.05% trypsin을 이용 하여 세포를 배양 용기로 부터 떼어낸 후 10% FBS가 함유된 MEM에 넣었다. 배양액에 넣어 부유시킨 세포들은 1x105cell/well이 되도록 산출한 후 96-well 용기에 넣은 다음, 36°C, 5%CO2로 조절 된 정온기에서 72시간 동안 배양하였다.
3. 소리쟁이 추출
소리쟁이는 채취한 즉시 대학부설 생명자원연구소에서 동정 확 인 후 사용하였다. 채취한 전초는 수회 세척한 후 바람이 잘 통하고 햇볕이 직접 들지 않은 서늘한 곳에서 건조시켰다. 건조 완료 후 일 정 길이로 잘라 냉암소에 보관하여 시료로 사용하였다. 시료추출을 위하여 보관중인 시료 57.9g을 파쇄기로 처리한 다음 1.000ml의 환저플라스크에 시료의 3배 정도의 증류수를 넣고 2시간 동안 가열 하였다. 동일 과정을 수번 반복하여 얻은 추출액을 모아 3,000rpm 에서 30분 동안 원심분리 한 후 상등액을 모아 여과시키고 이를 진 공농축기로 감압농축 후 동결건조하여 3.2g의 시료를 얻었다. 이 때 수율은 5.5%로 나타났다.
5. 항산화제 처리
배양중인 NIH3T3 섬유모세포에 XTT50농도의 CdCl2를 처리 하기 2시간 전에 항산화제인 vitamin E가 30μM과 40μM로 각각 포함된 배양액에서 전 처리한 다음 이의 영향을 세포생존율에 의하 여 양성대조군인 CdCl2와 비교 조사하였다.
6. 소리쟁이 추출물의 처리
소리쟁이 추출물이 CdCl2에 미치는 영향을 조사하기 위하여 XTT50농도의 CdCl2를 배양 세포에 처리하기 2시간 전에 110μg/ml 과 150μg/ml의 농도로 소리쟁이 추출물이 각각 포함된 배양액에 서 처리한 후 이의 영향을 대조군과 비교 조사하였다.
7. 세포생존율 측정
Mosmann(1983)의 방법에 따라, 배양중인 NIH3T3 섬유모세 포에 약제나 또는 추출물을 처리한 다음 XTT를 각 well당 10μl씩 넣고 4시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 DMSO를 넣어 정치시 킨 다음 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하 였다. XTT50값은 회귀직선식(regression equation)에 의하여 산 출하였다.
8. DPPH-라디칼 소거능 활성(DPPH-radical scavenging activity) 측정
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)-라디칼 소거능은 hydroxyl radical anion이나 superoxide anion 또는 hydrogen peroxide와 같은 자유라디칼을 제거하는 능력을 말하며 이의 측정 은 Blois(1958)의 방법에 의하였다. 즉, 시료를 메탄올에 농도별로 조제한 용액에 0.3mM DPPH 메탄올용액 100μl를 첨가하여 실온 에서 30분간 처리하였다. 처리 완료 후 ELISA를 이용하여 517nm 에서 흡광도를 측정하였다. DPPH-라디칼 소거능 측정은 vitamin E를 양성대조군으로 사용하였으며, 시료첨가군과 시료무첨가군 간의 차이를 시료무첨가군에 의한 백분율로 나타냈다.
9. 티로시나제 활성
티로시나제의 활성은 Choi et al.(2001)의 방법에 따라, 세포를 원심분리 시켜 침전물을 얻고 100μl의 세포용해액으로 처리한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 0.1M PBS에 1.5mM tyrosinase 용 액과 0.3ml의 시료액 및 티로시나제 효소액(1,250U/ml)을 넣은 다음 37°C에서 15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성은 대조군에 대한 백분율 로 표시하였으며, 티로시나제의 활성저해능은 시료용액의 첨가군 과 무첨가군의 흡광도 감소율에 대한 백분율로 표시하였다.
10. 총멜라닌양 측정
Hosoi et al.(1985)의 변형된 방법에 따라, 배양된 세포를 PBS 로 3회 세척후 1,500rpm에서 원침하였다. 원침 후 침전물에 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH를 200μl를 넣은 다음 80°C에서 1시 간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 ELISA reader로 405nm에서 흡 광도를 측정하였으며 실험군의 총멜라닌양은 대조군에 대한 백분 율로 표시하였다.
결과 및 고찰
1. CdCl2의 세포독성 측정
CdCl2의 세포생존율을 측정하기 위하여 50~70μM의 CdCl2 가 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 결과 처리 농도에 비례 하여 대조군에 비하여 세포생존율을 유의하게 감소시켰으며 (p<0.001), 이 과정에서 XTT50은 45.7μM에서 측정되었다(Table 1). 본 실험 결과는 Choi et al.(2012)이 CdCl2가 배양 골모세포에, Choi and Kim(1990)이 생쥐의 섬유모세포에, Son et al.(2012)이 배양 인체피부섬유모세포에 각각 세포독성을 나타냈다는 연구 결 과와 일치하였다. 본 연구에서 CdCl2는 Borenfreund and Puerner (1984)의 독성판정기준에 의하여 XTT50값이 100μM 이하로 나 타나 고독성인 것으로 나타났다. 본 실험에서 CdCl2에 의한 세포생 존율의 감소는 Coogan et al.(1992)이 보고한 CdCl2에 의한 세포 의 핵산물질의 합성억제나, 또는 Lowry et al.(1951)에 의한 세포 내 단백질합성의 저해와 같은 원인도 배제할 수는 없지만, 그 보다 는 CdCl2의 산화적 손상에 의한 결과일 가능성이 클 것으로 생각된 다(Bagchi et al., 2001). 이같은 근거의 하나로서 Son et al.(2012) 에 의한 CdCl2의 독성이 항산화제에 의하여 방어되었다는 연구 보 고가 이를 제시하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 CdCl2의 독성과 산화적 손상과의 관련성을 조사하였다.
2. CdCl2에 대한 항산화제의 영향
항산제인 vitamin E가 CdCl2에 미치는 영향을 조사하기 위하여 30μM과 40μM 농도의 vitamin E를 배양 세포에 각각 전 처리한 결과, CdCl2 XTT50값의 세포생존율은 대조군인 100%(0.121± 0.010)에 비하여 54.5%(0.066±0.005)로 나타난데 비하여, 30μ M 농도의 vitamin E에서는 84.3%(0.102±0.009)로 나타났으며, 또한, 40μM 농도에서는 91.7%(0.111±0.007)로 나타나 이는 모 두 CdCl2만의 처리에 비하여 유의한 증가를 나타냈다(p<0.001) (Table 2). 본 실험에서 항산화제인 vitamin E가 세포생존율을 증 가시킨 것은 CdCl2에 의한 산화적 손상을 vitamin E가 방어한 것 으로서, 이는 Son et al.(2012)이 CdCl2의 세포독성을 vitamin E 가 방어했다는 연구 결과와도 일치하였다. 본 실험이나 위의 타 연 구 결과는 CdCl2의 독성에 산화적 손상이 관여하고 있다는 것을 증 명하고 있음을 알 수 있다. 카드뮴은 산화적 손상과 같은 독성을 통 해 신장을 비롯한(Jin and Nordberg, 1983), 간장(Coogan et al., 1992), 또는 치아나 모발(Nowak. and Chmielnicka, 2000) 등과 같은 각종 장기에 영향을 미쳤다는 많은 보고에서와 같이 카드뮴은 강한 독성효과에 의해 환경유해인자로 분류되어 있다(Cho et al., 2012). 한편, vitamin E는 강력한 지용성 항산화제의 일종으로 신 호전달계에 속하는 protein kinase C(PKC)의 활성억제는 물론, 면역 및 염증세포의 활성 및 발현에 영향을 미친다. 더욱이 vitamin E는 지방과 저밀도 콜레스테롤의 산화를 억제함으로서 자유라 디칼을 차단하는 항산화제로서 중요한 작용을 한다(Jarvis and Neville, 2000).
3. 소리쟁이 추출물이 CdCl2에 미치는 영향
CdCl2의 세포독성에 대한 소리쟁이 추출물의 영향을 알아보기 위하여 110μg/ml와 150μg/ml 농도의 소리쟁이 추출물을 배양 세 포에 전 처리한 결과 XTT50농도의 CdCl2만을 처리한 경우 세포생 존율은 대조군인 100%(0.107±0.012)에 비하여 54.2%(0.058± 0.003)로 나타났다. 이에 비하여 110μg/ml 소리쟁이 추출물의 처 리에서는 70.1%(0.075±0.007)로 나타나 CdCl2만을 처리에 비하 여 유의한 증가를 나타냈다(p<0.01). 또한, 150μg/ml 소리쟁이 추 출물 처리에서도 세포생존율이 89.7%(0.096±0.008)로 나타남으 로서 이 역시 CdCl2만의 처리에 비하여 매우 유의하게 증가한 것으 로 나타났다(p<0.001)(Table 3). 본 실험 결과는 소리쟁이 추출물 이 CdCl2의 세포독성을 방어하였음을 말해주고 있으며, Kim et al.(2004)이 소리쟁이 추출물의 항산화능과 항균작용을 보고한 연 구 결과를 관련하여 볼 때, 소리쟁이 추출물이 CdCl2의 산화적 손 상을 방어한 결과임을 제시하고 있다. 이같은 소리쟁이의 항산화능 은 아마도추출물 성분 중에 페놀화합물 처럼 분자구조에 수산기를 가지고 있는 chrysophanol이나 emodin, flavonoid와 같은 성분들 에 의한 것으로 생각된다. 따라서, 본 실험에서는 소리쟁이 추출물 에 대한 항산화능을 알아보기 위하여 라디칼 소거능을 조사하였다.
Table 3.
The protective effect of Rumex crispus L. extract on CdCl2-induced cytotoxicity in cultured NIH3T3 fibroblasts.
| Concentration | XTT assay (450nm) | |
|---|---|---|
|
|
||
| RCLx extract (µg/ml) | Mean±S.D.z | (% of control) |
|
|
||
| Control | 0.107±0.012 | 100 |
| XTT50 (CdCl2)y | 0.058±0.003 | 54.2 |
| 110 | 0.075±0.007 | 70.1** |
| 150 | 0.096±0.008 | 89.7*** |
4. DPPH-라디칼 소거능 측정
소리쟁이 추출물 시료에 대한 라디칼 소거능의 측정에서, 110μ g/ml 추출물 처리에서는 소거능값이 대조군에 비하여 48.1%로 나 타났으며 150μg/ml 농도의 추출물 처리에서는 63.0%로 나타나 이 모두 대조군에 비하여 유의한 활성 증가를 보였다(p<0.001). 더 욱이 150μg/ml 추출물 처리에서는 양성대조군인 vitamin E 값의 80% 이상의 소거능값을 나타냈다(Table 4). 본 연구 결과는 소리 쟁이 추출물이 라디칼을 제거할 수 있는 항산화능이 있다는 것을 말해주고 있으며, 앞서 행한 본 실험의 CdCl2에 대한 소리쟁이 추 출물의 세포생존율 분석 결과에서도 이를 증명하고 있다. DPPH- 라디칼 소거능은 지질과산화(lipid peroxidation) 및 SOD-유사활 성(superoxide dismutase-like activity) 분석과 같이 항산능을 측 정하는 대표적인 지표분석으로 비색분광법에 의한 정량적 분석법 이다(Marklund and Marklund, 1974). 소리쟁이와 같은 마디풀 과에 속하는 식물들의 몇 가지 공통적인 함유성분에 속하는 chrysophanol이나 emodin, rhaponticin, polydatin, tannin, flavonoid 등을 살펴 보면, 이들의 분자구조에 페놀화합물 처럼 대 개 1개 이상의 수산기를 가지고 있어 강력한 항산화 작용을 가지고 있음을 알 수 있다.
5. 티로시나제(tyrosinase)활성 측정
소리쟁이 추출물에 대한 티로시나제의 활성을 조사하기 위하여 각각 110μg/ml와 150μg/ml의 추출물을 처리한 결과 110μg/ml 농도에서는 티로시나제 활성이 CdCl2만의 처리인 102.9%에 비하 여 87.1%로 유의한 감소를 나타냈다(p<0.05). 또한, 150μg/ml의 농도의 추출물 처리에서는 81.4%로서 이 역시 CdCl2만의 처리에 비하여 매우 감소된 활성을 나타냈다(p<0.01)(Table 5). 본 연구 결과는 소리쟁이 추출물이 티로시나제의 활성을 억제했음을 말해 주고 있으며, 이는 또한 소리쟁이 추출물이 멜라닌 합성의 억제능 이 있다는 것을 말해 주고 있다(Spritz et al., 1991). 본 연구에서 티 로시나제의 활성과 산화적 손상과의 연관성을 고려해 볼 때 (Pannala et al., 1998), 소리쟁이 추출물에 의한 CdCl2의 산화적 손상방어가 티로시나제의 활성을 억제하였을 것으로 생각된다. 따 라서 본 연구에서는 이를 확인하기 위하여 소리쟁이 추출물에 대한 총멜라닌양을 조사하였다.
6. 총멜라닌양 측정
소리쟁이 추출물에 대한 총멜라닌양을 측정하기 위하여 110μg/ml 와 150μg/ml 농도의 추출물을 처리한 결과 110μg/ml 농도 처리에 서는 총멜라닌양이 XTT50농도의 CdCl2만의 처리인 103.3%에 비하여 93.3%로 유의한 감소를 나타냈다(p<0.05). 또한, 150μ g/ml 추출물 처리에서는 총멜라닌양이 73.3%로 이 역시 CdCl2만 의 처리에 비하여 매우 유의하게 감소하였다(p<0.001) (Table 6). 본 연구 결과는 소리쟁이 추출물이 멜라닌합성을 저해한 것으로, 이는 다시말해 소리쟁이 추출물의 티로시나제 활성억제능에 의한 멜라닌 합성의 감소를 보인 것으로 앞서 행한 본 연구의 티로시나 제의 활성분석과 일치함을 알 수 있었다. 멜라닌화는 산화적 손상 이 관여되어 있다고 알려져 있는데(Kang et al., 2007), 이는 산화 적 손상이 멜라닌세포로 하여금 멜라닌합성 및 티로시나제의 활성 을 유도함으로서 멜라닌화를 촉진시키기 때문인 것으로 밝혀져 있 다(Lerner and Fitzpateick., 1984). 그러나, 소리쟁이 추출물과 같 은 천연성분의 생리활성에 대한 더욱 자세한 기전규명을 위해서는 천연물의 성분분석은 물론, 세포분자적 및 신호전달체계와 같은 측 면에서 체계적인 연구가 이루어져야 할 필요성이 있다고 생각된다.
적요
마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 소리쟁이(Rumex crispus L.) 추출물이 환경오염원인 염화카드뮴(CdCl2)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3 fibroblast) 를 재료로, 이의 항산화(antioxidation) 및 멜라닌화(melanogenesis) 에 대한 영향을 조사하였다. 본 연구에서 CdCl2는 배양 NIH3T3 섬유모세포에 처리한 농도에 비례하여 세포생존율을 유의하게 감 소시켰으며(p<0.001), 이 과정에서 XTT50값은 45.7μM로 측정되 었다. 또한, 이 값은 Borenfreund and Puerner에 의한 독성판정기 준에 따라 고독성인 것으로 나타났다. 한편, 항산화제인 vitamin E 는 CdCl2에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로 서 CdCl2의 세포독성을 방어하였다. CdCl2의 세포독성에 대한 소 리쟁이 추출물의 영향에 있어서는, 소리쟁이 추출물은 CdCl2만의 처리에 비하여 세포생존율을 유의하게 증가시켰으며(p<0.001), 또한 DPPH-라디칼 소거능(DPPH-radical scavenging activity) 에 의한 항산화능을 나타냈다. 멜라닌화에 있어서, 소리쟁이 추출 물은 CdCl2에 의하여 증가된 티로시나제(tyrosinase) 활성과 총멜 라닌양을 모두 유의하게 감소시켰다(p<0.001). 이상의 결과로부 터 CdCl2의 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있으며, 소리쟁이 추출물은 항산화능에 의하여 CdCl2의 세포독성을 효과적으로 방 어하였다. 또한 소리쟁이 추출물은 티로시나제 활성과 총멜라닌양 을 유의하게 감소시킴으로서 멜라닌화를 방어하는데 효과적인 것 으로 나타났다. 따라서 소리쟁이와 같은 천연물을 대상으로 CdCl2 처럼 산화적 손상과 관련된 중금속계 환경오염원의 독성으로부터 보호할 수 있는 물질에 대한 탐색 및 개발은 이의 활용적 가치가 크 다고 생각된다.
PDF Links
PubReader
Full text via DOI
Download Citation
