관중속 3종의 메탄올 추출물 및 참지네고사리 분획물의 α-glucosidase 억제 활성
Alpha-glucosidase Inhibition Activity of Methanol Extracts Obtained from Three Dryopteris Species and Fractions Obtained from D. nipponensis
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Abstract
This study was performed to analyze the α-glucosidase inhibitory activity in fronds of 3 Dryopteris species, D. crassirhizoma, D. nipponensis and D. fragrans var. remotiuscula, and in rhizomes of D. crassirhizoma and D. nipponensis, and then to explore the natural materials for developing natural α-glucosidase inhibitors. An analysis was performed using the crude extract of fronds and rhizomes obtained through 30 minutes ultra sonification extraction in 42 kHz ultrasonic water tank with 100% methanol, as a solvent, after the freeze drying and grinding. As a result of the analysis of α-glucosidase inhibitory activity, in respect of IC50 values of fronds and rhizomes, D. nipponensis was the highest as 4.13 and 2.19µg·mL-1 respectively among 3 Dryopteris species and their inhibitory activities were 342 and 646 times higher than acarbose(IC50=1413.70µg·mL-1) used as control group, respectively. In respect of the biomass required to inhibit 50% of α-glucosidase activity, the fronds and rhizomes of D. nipponensis required the least as 0.04 and 0.05mg, respectively. From the crude extract, D. nipponensis with high α-glucosidase activity and less required biomass was selected. And then the crude extract was subdivided by the solution in the order of n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol and water in order to analyze α-glucosidase inhibitory activity as well as the biomass required for each fraction comparatively. The fronds of D. nipponensis was high in n-butanol fraction(1.09µg·mL-1), and the rhizome was high in water fraction(9.36µg·mL-1), indicating the inhibitory activity 1297 and 151 times higher than acarbose, respectively. The required biomass of the fronds and rhizomes of D. nipponensis were highest in n-butanol and water fraction. As a result of this study, the crude extract of D. nipponensis showed high α-glucosidase inhibitory activity requiring a small amount of biomass. Thus, its value for the development to antidiabetic agent is considered very high.
I. 서론
최근에 서구화된 식습관, 운동 부족 등 생활양식의 변화와 고령 화로 인하여 당뇨병, 동맥경화, 심장병, 암 등의 만성 퇴행성 질환 발생률이 증가하고 있다(Kim et al., 2013). 이러한 만성 퇴행성 질 환 중 대표적인 당뇨병은 인슐린, 글루카곤 등 호르몬의 불균형으 로 인한 당질, 단백질 및 전해질 대사 등 생리적 대사 조절기능에 이 상이 발생하여 고혈당이 나타나게 된다. 고혈당 증상이 지속되면 신체의 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등의 기관에서 심각한 합병증이 유발된다(Abrams et al., 1982; Bantle et al., 2000; Choi et al., 1990; Stratton et al., 2000; Tovar et al., 2007).
당뇨병의 발생과 합병증을 치료하기 위하여 사용되는 α- glucosidase 저해제는 소장점막에서 이당류와 과당류의 분해효소 를 가역적으로 저해하여 탄수화물의 흡수를 지연하고, 식후 혈당상 승을 감소시켜, 제 2형 당뇨병에 효과가 있다(Bell, 2004; Lebovitz, 1997). 제 2형 당뇨병에 효과가 있는 α-glucosidase 저해제는 acarbose, voglibose, miglitol 등이 있다(Gholamhoseinian et al., 2009; Kang et al., 2009; Rosak and Mertes, 2009). 그러나 현재 사용 중인 α-glucosidase 저해제는 설사와 복통 등의 부작용 을 유발하므로, 부작용이 없는 천연물 및 식물을 이용한 α- glucosidase 억제제의 개발을 위한 연구가 진행 중에 있다(Lim et al., 2005).
본 연구는 Shin(2010)의 선행연구에서 총 폴리페놀 함량 및 ABTS radical 소거활성이 높은 것으로 나타난 관중속(Dryopteris) 의 관중(D. crassirhizoma), 참지네고사리(D. nipponensis)와 주 저리고사리(D. fragrans var. remotiuscula) 등 3종의 성엽 및 근 경의 α-glucosidase 억제활성을 구명하여 천연 기능성 소재로써의 활용가치를 평가하기 위하여 수행하였다. 그리고 α-glucosidase 억제활성을 보이는 추출물을 제조하는 데 필요한 생체량을 구하여, 소량으로 우수한 생리활성을 보이는 경제적인 기능성 식물소재를 선발하고자 하였다.
II. 연구 방법
1. 식물 재료 추출 및 분획
본 연구에서는 관중(Dryopteris crassirhizoma), 참지네고사리 (D. nipponensis)와 주저리고사리(D. fragrans var. remotiuscula) 등 관중속 양치식물 3종을 연구재료로 사용하였다(Table 1). 각 자 생지에서 수집한 양치식물은 70% 차광 처리된 무가온 온실에서 가 습기(JA-1200, 중앙기술산업, 한국)를 가동하여 공중습도를 85% 수준으로 유지된 상태에서 1년간 재배한 것을 사용하였다. 성엽은 엽색이 3개의 식물체로 부터 가장 진한 시기에 성숙한 잎을 골라 채 집하였으며, 포자가 없는 영양엽을 재료로 사용하였다. 근경은 신 선한 것을 사용하기 위하여 채집 후 절단하여 내부가 녹색인 것만 선별하여 실험재료로 사용하였다. 단, 주저리고사리의 근경은 수 확량이 적어 실험재료로 사용하지 않았다.
Origins and parts of three Dryopteris species used for this study.
관중속 3종은 수확한 다음 세척 후 절단하여 동결건조기(FD8512, IlShin Lab. Co. Ltd., Korea)를 이용하여 24∼48 시간 동안 동결 건조하였다. 건조한 시료는 분쇄기(FM-681C, Hanil Electric, Korea)로 분쇄하였다. 분쇄 시료는 메탄올과 함께 병에 담아 Shin (2010)의 방법을 이용하여 초음파 수조(5510-DTH, Bransonic, USA)에서 30분 동안 초음파 추출을 실시하였다. 추출액은 여과지 (Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Japan)를 사용하여 vacuum pump(GAST, USA)로 감압여과하였다. 여과된 추출물 은 질소 충전하여 -70±2℃의 deep freezer(SW-UF-200, Samwon Engineering Co., Korea)에 저장하면서 실험에 사용하였다.
용매분획은 100% 메탄올을 용매로 한 초음파 추출물의 α- glucosidase 억제활성이 높고, 필요 생체량이 가장 적었던 참지네 고사리 성엽 및 근경의 조추출물을 감압농축하여 조추출물을 얻었 다. 가용성 고형분과 초순수를 혼합하여 분획용매를 혼합하여 분획 하였다. 용매 분획은 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, nbutanol 및 water 순차적으로 하였으며, 각 분획층은 rotary vacuum evaporator로 감압농축하였다.
2. α-Glucosidase 억제활성 측정
α-D-glucoside glucohydrolase(α-glucosidase)는 0.7unit의 농도로 0.1M sodium buffer(pH 7.0)에 용해하여 사용하였으며, 4 단계로 희석한 농도별 추출물 50μL에 α-glucosidase 효소액 100μ L를 넣고 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1.5mM ρ- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(ρ-NPG)를 50μL 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 1M Na2CO3 1mL를 첨가하여 반응 을 정지시킨 뒤, 405nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim et al., 2004). α-glucosidase에 대한 억제활성(IC50)은 대조구의 흡광도 를 50% 감소시키는 데 필요한 농도로 나타냈으며, [α-glucosidase inhibition(%) = [1-(대조구 흡광도-시료 흡광도)/(대조구 흡광도- 시료 무첨가구 흡광도)] × 100]의 식을 이용하여 환산하였다. 각 추 출물의 α-glucosidase 억제활성을 비교하기 위한 대조군으로 α- glucosidase 억제제인 4",6"-dideoxy-4"-([1S]-[1,4,6/5]-4,5,6- trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-yclohexenylamino)-maltotrio se(acarbose)를 사용하였다. 모든 실험은 각 처리구 시료에 대하여 9반복 실험하였다. 통계처리는 평균±표준오차(mean±SE)로 표기 하였다.
3. 필요 생체량 분석
α-glucosidase를 50% 억제할 수 있는 가용성 고형분을 제조하 기 위해 필요한 식물의 생체량을 얻기 위하여 식물재료의 수분함 량, 추출수율 및 추출물의 IC50 값을 종합적으로 고려하여, [필요 생 체량(mg) = {추출물의 IC50값/가용성 고형분(gㆍg DW)}/{(100- 수분함량)/100}]의 식을 이용하여 환산하였다.
III. 결과 및 고찰
1. 수분함량 및 가용성 고형분
관중속 3종의 성엽 및 근경의 수분함량 및 가용성 고형분 함량은 Table 2 와 같다. 수분함량은 65.02∼76.09%이었으며, 주저리고 사리 성엽의 수분함량(76.09%)이 가장 많았다. 가용성 고형분 함 량은 0.17∼0.28g·g-1 범위였으며, 참지네고사리 성엽의 가용성 고형분 함량(0.17g·g-1)이 가장 많았다.
Moisture contents of fresh materials and soluble solid contents of extracts obtained from three Dryopteris species.
2. 관중속 3종의 부위에 따른 α-glucosidase 억제활성 결과 및 필요 생체량 분석
관중, 참지네고사리 및 주저리고사리의 성엽 및 근경 메탄올 추 출물의 α-glucosidase 억제활성을 분석한 결과, 참지네고사리가 성 엽 및 근경의 메탄올 추출물에서 각각 4.13, 2.19μg·mL-1로 본 연구 에 사용된 관중속 양치식물 3종 중에서 가장 높은 α-glucosidase 억 제활성을 보였으며, 대조구인 acarbose(IC50=1413.70μg·mL-1) 에 비해 각 342.30, 645.53배 높았다(Table 3). 또한 관중과 주저리 고사리 성엽 및 근경의 메탄올 추출물도 acarbose에 비해 54.97∼ 108.00배의 높은 α-glucosidase 억제활성을 보였다. α-Glucosidase 활성을 50% 억제시키기 위한 가용성 고형분(IC50)을 생산하는 데 필요한 생체량도 참지네고사리의 성엽(0.04mg)과 근경(0.05mg) 에서 가장 적었다(Table 3).
IC50 value ofα-glucosidase inhibitory activity in three Dryopteris species.
α-glucosidase 억제활성이 가장 높았던 참지네고사리는 구진, 농포, 낭종 등 피부질환의 주원인으로 알려진 Propionibacterium acnes에 대하여 항균활성이 높은 것으로 밝혀졌다(Layton, 2006; Leeming et al., 1997). 또한 항산화 물질로 알려진 총 폴리페놀 함 량이 높고, DPPH 및 ABTS radical 소거활성이 합성 항산화제로 알려진 BHT에 비해 효과가 좋은 것으로 나타나(Shin, 2010), α- glucosidase 억제활성과 radical 소거활성이 상관관계가 있음을 알 수 있었다(Kim et al., 2013b). Xu et al.(2010)의 토후박[후박 나무(Machilus thunbergii)의 껍질], Lee et al.(2010)의 마전자 [(Strychnos nux-vomica)의 종자] 추출물에서도 α-glucosidase 억제활성과 DPPH radical 소거활성의 연관성을 확인할 수 있었다. 연구의 결과, 관중속 식물 3종은 적은 양으로도 α-glucosidase 억제 활성 효과가 있으며, 그중에서도 참지네고사리는 항산화 활성도 우 수하여 경제적인 항당뇨 소재로 개발할 수 있을 것으로 생각된다.
3. 참지네고사리의 부위별 분획물의 가용성 고형분
참지네고사리 성엽 및 근경 분획물의 가용성 고형분 함량을 분 석한 결과, 가용성 고형분은 대체로 성엽이 근경에 비해 많았으며, 부위와 용매의 종류에 따라 뚜렷한 차이를 나타냈다(Table 4). 가 용성 고형분은 부위에 따라 달랐는데, 성엽은 water 분획물(70.87 mg·g-1), 근경은 n-hexane 분획물(42.71mg·g-1)에서 가장 많았다.
Soluble solid contents and IC50 value of α-glucosidase inhibitory activity of solvent fractions obtained from frond and rhizome of Dryopteris nipponensis.
4. 참지네고사리의 부위별 분획물의 α-glucosidase 억제 활성 결과 및 필요 생체량 분석
참지네고사리 성엽의 분획물별 α-glucosidase 억제활성은 n-butanol 분획물(1.09μg·mL-1)에서 가장 높았으며, 대조구인 acarbose의 억제활성(1413.70μg·mL-1)에 비해 1,297배 높았다 (Table 4). 다음으로 water, chloroform, n-hexane, ethyl acetate 분획물의 순으로 각 98∼18배의 높은 억제활성을 보였다. 근경은 water 분획물에서 가장 높았으며, acarbose에 비해 151배 높은 α- glucosidase 억제활성을 보였다. Water 분획물 다음으로 n-butanol, ethyl acetate, chloroform, n-hexane 분획물 순으로 α-glucosidase 억제활성이 acarbose에 비해 각 89∼16배 높은 것으로 분석되었 다. 이상의 결과는 면마과(Aspidiaceae)의 분획물에 대한 연구 (Kim et al., 2013a)에서 가장 높은 억제활성을 보였던 나도히초미 [Polystichum polyblepharum(Roem. ex Kunze) C.Presl var. polyblepharum] 근경의 n-butanol 분획물(4.47μg·mL-1)이나, 기 생초(Coreopsis tinctoria)의 분획물에 대한 연구(Hwang et al., 2010)에서 높은 α-glucosidase 억제활성을 보였던 ethyl acetate 분획물(0.125mg·mL-1)에 비해서도 월등히 높았다.
α-glucosidase의 활성을 50% 억제하기 위한 가용성 고형분 (IC50)을 생산하는 데 필요한 참지네고사리 성엽의 분획물별 생체 량은 억제활성이 가장 높았던 n-butanol 분획물에서 가장 적은 양 을 필요로 하였다(Table 4). 근경의 경우에는 water 분획물이 α- glucosidase를 50% 억제하는 데 가장 적은 생시료를 필요로 하였 다. n-Hexane 분획물 가용성 고형분의 IC50값은 90.23μg·mL-1로 다른 분획물에 비해 억제활성이 낮았으나, 비교적 높은 가용성 고 형분 함량으로 인하여 water 분획물 다음의 적은 생체량으로 α- glucosidase를 50% 억제할 수 있는 것으로 분석되었다.
Shin(2010)의 연구에서 참지네고사리는 생리활성물질 함량 및 항산화능이 우수한 식물로 알려져 있다. 따라서 참지네고사리의 성 엽 및 근경은 α-glucosidase 억제활성뿐만 아니라 다양한 기능성 물 질 및 활성이 많으므로 향후 건강 생물소재로써 이용 가치가 높다. 또 한 α-glucosidase 50%를 억제하기 위한 추출물을 제조하는 데 소요 되는 생시료의 양이 가장 적으므로 biomass가 높아 경제적인 항당뇨 제를 개발하기 위한 천연소재로 사용할 수 있을 것으로 생각되었다.
IV. 적요
본 연구는 관중속(Dryopteris) 3종인 관중(D. crassirhizoma), 참지네고사리(D. nipponensis)와 주저리고사리(D. fragrans var. remotiuscula)의 성엽 및 관중, 참지네고사리의 근경의 α-glucosidase 억제활성을 분석하여 천연 α-glucosidase 저해제의 개발을 위한 천 연소재를 탐색하기 위하여 수행하였다. 관중속 3종의 성엽 및 근경 을 동결건조하여 분쇄한 다음 100% 메탄올을 용매로 42kHz의 초 음파 수조에서 30분간 초음파 추출하여 얻은 조추출물을 사용하여 분석하였다. 관중속 3종의 α-glucosidase 억제활성을 분석한 결과, 성엽 및 근경에서 IC50 값은 참지네고사리가 각 4.13, 2.19μg·mL-1로 가장 높았으며, 대조구로 사용한 acarbose(IC50=1413.70μg·mL-1) 에 비해 억제활성이 각 342.30, 645.53배 높았다. α-glucosidase 활 성의 50%를 억제하기 위한 필요 생체량은 참지네고사리의 성엽 및 근경이 각 0.04, 0.05mg의 가장 적은 양을 필요로 하였다. 조추출물 에서 α-glucosidase 억제활성이 높고 필요 생체량이 적었던 참지네 고사리를 선발하여, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 및 water 순으로 용매별 분획한 다음 각 분획물에 대한 α-glucosidase 억제활성 및 필요 생체량을 비교 분석하였다. 참지네고사리의 성엽 은 n-butanol 분획물(1.09μg·mL-1), 근경은 water 분획물(9.36μ g·mL-1)에서 높았으며, acarbose에 비해 각 1296.97, 151.04배의 높은 억제활성을 나타냈다. 필요 생체량을 분석한 결과에서도, 참지 네고사리의 성엽과 근경은 각각 n-butanol, water 분획물에서 가장 높았다. 본 연구의 결과, 참지네고사리의 조추출물은 적은 생체량으 로도 높은 α-glucosidase 억제활성을 나타내기 때문에 항당뇨제 천 연소재로써의 개발가치가 매우 높은 것으로 생각되었다.